Perbandingan struktur protein ribonuklease H perwakilan daripada setiap subjenis. Dalam protein E. coli (kuning, kiri atas), empat sisa tapak aktif yang dipelihara ditunjukkan sebagai sfera. Dalam protein H. sapiens, teras struktur biasa antara subjenis H1 dan H2 ditunjukkan dalam warna merah. Struktur diberikan daripada: E. coli, PDB: 2RN2​ T. maritima, PDB: 303F​ B. stearothermophilus, PDB: 2D0B​ H. sapiens H1, PDB: 2QK9​ H. sapiens, PDB: 3P56​

Struktur RNase H biasanya terdiri daripada β-helaian 5 untai yang dikelilingi oleh taburan α-heliks.[9] Semua RNase H mempunyai tapak aktif yang berpusatkan motif jujukan terpelihara yang terdiri daripada sisa aspartat dan glutamat, sering dirujuk sebagai motif DEDD. Sisa-sisa ini berinteraksi dengan ion magnesium yang diperlukan dalam pemangkinan.[6][4]

RNase H2 lebih besar daripada H1, dan biasanya mempunyai heliks tambahan. Organisasi domain enzim berbeza-beza; sesetengah ahli kumpulan H1 prokariot dan eukariot kebanyakan mempunyai domain kecil tambahan di terminal N yang dikenali sebagai "domain pengikatan hibrid" yang memudahkan pengikatan kepada dupleks hibrid RNA:DNA dan kadangkala memberikan peningkatan proses.[2][6][10] Walaupun semua ahli kumpulan H1 dan ahli prokariot kumpulan H2 berfungsi sebagai monomer, enzim H2 eukariot ialah heterotrimer wajib.[2][6] Enzim HIII prokariot ialah ahli kumpulan H2 yang lebih luas, dan berkongsi kebanyakan ciri struktur dengan H2, dengan penambahan domain pengikat kotak TATA terminal N.[6] Domain RNase H retrovirus yang wujud dalam protein transkripase terbalik multidomain mempunyai struktur yang hampir menyerupai kumpulan H1.[4]

RNase H1 telah dikaji secara meluas untuk meneroka hubungan antara struktur dan aktiviti enzim. Ia juga digunakan, terutamanya homolog E. coli, sebagai sistem model untuk mengkaji lipatan protein.[11][12][13] Dalam kumpulan H1, satu hubungan telah dikenal pasti antara pertalian pengikat substrat yang lebih tinggi dengan kehadiran elemen struktur yang terdiri daripada gelung heliks dan fleksibel yang menyediakan permukaan pengikat substrat yang lebih besar dan berbes. Heliks C mempunyai taburan taksonomi bertaburan; ia terdapat dalam homolog E. coli dan RNase H1 manusia, manakala tiada dalam domain HIV RNase H, tetapi contoh domain retrovirus dengan heliks C memang wujud.[14][15]